Объект-микрометр ОМОиП-М1 отражённого и проходящего света для микроскопа с ценой деления 0,01 мм для калибровки систем визуализации и измерения

Объект-Микрометр предназначен для калибровки систем визуализации и измерения цифровых микроскопов, что обеспечивает измерение линейных размеров объектов и выполнение иных расчетов, основанных на измерении и обработке линейных размеров в поле зрения микроскопа в проходящем свете, темном поле, фазовом контрасте, люминесценции, поляризации, в отраженном свете и иных видах исследований на микроскопе.

В цифровых микроскопах Объект-Микрометр применяется для проведения калибровки цифровой системы визуализации микроскопа для последующего автоматического измерения расстояний. Цифровая система визуализации микроскопа состоит из Программного Обеспечения (далее по тексту ПО) и цифровой камеры. Чтобы в ПО появилась возможность измерения и анализа изображений, необходимо определить коэффициент

пересчета размера микрообъекта, измеренного в условных единицах «Пиксель» (разрешение цифровой камеры) в размеры метрической системы СИ «Микрометры» (или нм, мм).

Сняв изображение шкалы Объект-Микрометра при каждом рабочем увеличении микроскопа и указав известное расстояние в режиме калибровки, Вы задаете коэффициент пересчета на реальные единицы длины в международной системе СИ (метр, миллиметр, микрометр, нанометр и т.д.).

Также Объект-Микрометр используется для определения увеличения и линейного поля зрения микроскопов, микропроекторов, а также цены деления окуляр-микрометра, окулярных шкал и сеток.

Стеклянная пластина 75 х 25 х 1 мм

Шкала длиной — 1 мм в окружности диаметром 5 мм

Цена деления шкалы — 0,01 мм

Количество делений в шкале – 100 шт

Толщина риски деления – около 0,003 мм

На Объект-Микрометр нанесена маркировка 1 DIV = 0.01mm

Объект-Микрометр представляет собой стеклянную пластину 75 мм х 25 х 1 мм, что соответствует стандартным размерам предметного стекла, используемого в микроскопии. В центре стекла выгравирована линейка длиной 1 мм, разделенная на 100 частей. Следовательно, Показание одного деления соответствует 0,01 мм, что равно 10 мкм.

Объект-Микрометр поставляется в штатном пластиковом футляре, что позволяет защитить стекло Объект-Микрометра от повреждения при транспортировке и хранении.

Окружность вокруг самой шкалы позволяет удобно и быстро находить шкалу Объект-Микрометра в окуляры микроскопа или в поле зрения микроскопа с цифровой системой визуализации при выводе изображения на экран монитора компьютера.

Следует помнить, что для калибровки на увеличении 100Х необходимо использовать иммерсионное масло (для масляных объективов).

Объект-Микрометр беречь от ударных нагрузок и изгибов, хранить в штатном пластиковом футляре. При чистке Объект-Микрометра от остатков биоматериала и иммерсионного масла исключить использование абразивных чистящих средств.

Определение показаний прибора

Указателем при отсчете по шкале 2 стебля служит торец барабана, а продольный штрих 1 является указателем для круговой шкалы 3. Пронумерованная шкала стебля показывает количество миллиметров, а его дополнительная шкала служит для подсчета половин миллиметров.

Отметим последний полностью открытый барабаном штрих миллиметровой шкалы стебля. Его значение составляет целое число миллиметров, и на рисунке он обозначен зеленым цветом. Если правее этого штриха имеется открытый штрих дополнительной шкалы (выделен голубым), нужно прибавить 0,5 мм к полученному значению.

При отсчете показаний круговой шкалы 3 в расчет берут то её значение, которое совпадает с продольным штрихом 1. Таким образом, на верхнем изображении показания прибора составляют:

• 16 + 0,22 = 16,22 мм.
• 17 + 0,5 + 0,25 = 17,75 мм.

Распространенной ошибкой является случай, когда неверно учитывают (или не учитывают) величину 0,5 мм. Это связано с тем, что ближайший к барабану штрих дополнительной шкалы может быть открыт частично. При необходимости проверьте себя с помощью штангенциркуля.

Вариант 1. Применение в оптической системе

1. Извлечь Объект-Микрометр из футляра. Убедиться в чистоте стекла, при необходимости – очистить;
2. Поместить Объект-Микрометр на предметный стол микроскопа, стороной, на которую нанесена шкала – к образцу светопроницаемого биологического или гистологического материала.
3. Используя объектив 4х, поймать с помощью регулировок микроскопа фокус на биологическом объекте и отцентровать в поле зрения шкалу Объект-Микрометра путем перемещения предметного стола.
4. Переключиться на необходимый для измерения биологического препарата объектив, отрегулировать фокусное расстояние и откорректировать положение предметного стола с помощью регулировок микроскопа;
5. Сделать измерение размеров клеток биологического или гистологического препарата, совмещенного со шкалой Объект-Микрометра для микроскопа.

Порядок проведения измерений микрометром

Рабочие поверхности микрометра разводят на величину чуть большую, чем размер измеряемой детали, иначе при работе можно её поцарапать. Дело в том, что торцевые поверхности пятки и микрометрического винта имеют высокую твердость для устойчивости к истиранию.
Пятку слегка прижимают к детали и вращают микрометрический винт с помощью трещотки до соприкосновения его с измеряемой поверхностью. Трещотка служит для регулирования усилия натяга – делается обычно 3 – 5 щелчков. Положение микрометрического винта фиксируют с помощью стопорного устройства для того, чтобы не сбить показания при считывании значений со шкалы.

В процессе работы с микрометром его следует держать за скобу таким образом, чтобы была видна шкала стебля, и показания можно было снять на месте.

При измерении диаметра вала, измерительные поверхности нужно выставлять в диаметрально противоположных точках. При этом пятка прижимается к валу, а микрометрический винт, который медленно вращают трещоткой, последовательно выравнивается в двух направлениях: осевом и радиальном. После работы необходимо проверить точность инструмента с помощью эталона.

Микрометр

Микрометр позволяет повысить точность измерений по сравнению со штангенциркулем на порядок, т. е. еще в 10 раз. Микрометры бывают нескольких типов: для наружных измерений, микрометрический глубиномер и микрометрический нутромер.

Микрометр для наружных измерений изображен на рис. И.4.

Для измерения предмет помещают между неподвижным упором
1
и подвижным торцом микрометрического винта
2
. Микрометрический винт, жестко связанный с барабаном
3
, перемещается внутри полого неподвижного цилиндра
4
. Микрометрический винт имеет шаг 0,5 мм.

Отсчетное устройство микрометра состоит из двух шкал – горизонтальной и круговой. Горизонтальная шкала, размещенная на неподвижном цилиндре, вдоль которого перемещается барабан, имеет цену деления 0,5 мм. Она представляет собой двойную шкалу, нанесенную по обе стороны продольной черты таким образом, что верхняя шкала сдвинута относительно нижней на 0,5 мм. Следовательно, когда микрометрический винт делает полный оборот, барабан перемещается от верхнего деления до нижнего Цена деления круговой шкалы, размещенной на конической части барабана, равна 0,01 мм. Действительно, число делений на барабане n

=50. Значит, при повороте на 50 делений барабан перемещается на 0,5 мм, а при повороте на одно деление – на 0,01 мм.

Отсчет производится следующим образом: по горизонтальной шкале цилиндра отсчитывается размер измеряемого предмета с точностью до 0,5 мм. Сотые доли миллиметра отсчитываются по круговой шкале барабана. Причем число сотых долей соответствует делению шкалы, расположенному против продольной черты цилиндра. Полученные результаты складываются.

Внимание!Микрометрический винт необходимо вращать только за трещотку 5

до возникновения характерного звука. Это предотвращает поломку прибора.

Микрометр позволяет повысить точность измерений по сравнению со штангенциркулем на порядок, т. е. еще в 10 раз. Микрометры бывают нескольких типов: для наружных измерений, микрометрический глубиномер и микрометрический нутромер.

Микрометр для наружных измерений изображен на рис. И.4.

Для измерения предмет помещают между неподвижным упором
1
и подвижным торцом микрометрического винта
2
. Микрометрический винт, жестко связанный с барабаном
3
, перемещается внутри полого неподвижного цилиндра
4
. Микрометрический винт имеет шаг 0,5 мм.

Отсчетное устройство микрометра состоит из двух шкал – горизонтальной и круговой. Горизонтальная шкала, размещенная на неподвижном цилиндре, вдоль которого перемещается барабан, имеет цену деления 0,5 мм. Она представляет собой двойную шкалу, нанесенную по обе стороны продольной черты таким образом, что верхняя шкала сдвинута относительно нижней на 0,5 мм. Следовательно, когда микрометрический винт делает полный оборот, барабан перемещается от верхнего деления до нижнего Цена деления круговой шкалы, размещенной на конической части барабана, равна 0,01 мм. Действительно, число делений на барабане n

=50. Значит, при повороте на 50 делений барабан перемещается на 0,5 мм, а при повороте на одно деление – на 0,01 мм.

Отсчет производится следующим образом: по горизонтальной шкале цилиндра отсчитывается размер измеряемого предмета с точностью до 0,5 мм. Сотые доли миллиметра отсчитываются по круговой шкале барабана. Причем число сотых долей соответствует делению шкалы, расположенному против продольной черты цилиндра. Полученные результаты складываются.

Внимание!Микрометрический винт необходимо вращать только за трещотку 5

до возникновения характерного звука. Это предотвращает поломку прибора.

Устройство гладкого микрометра типа мк-25

Основные элементы конструкции гладкого микрометра представлены на рисунке ниже и обозначены цифрами:

1. Скоба. Она должна быть жесткой, поскольку её малейшая деформация приводит к соответствующей ошибке измерения.
2. Пятка. Она может быть запрессована в корпус, а может быть сменной у микрометров с большим диапазоном измерений (500 – 600 мм, 700 – 800 мм и т.д.).
3. Микрометрический винт, который перемещается при вращении трещотки 7.
4. Стопорное устройство. У микрометра на рисунке оно выполнено в виде винтового зажима. Используется для фиксации микрометрического винта при настройке прибора или снятии показаний.
5. Стебель. На него нанесены две шкалы: пронумерованная (основная) показывает количество целых миллиметров, дополнительная – количество половин миллиметров.
6. Барабан, по которому отсчитывают десятые и сотые доли миллиметра. Торец барабана также является указателем для шкалы стебля 5.
7. Трещотка для вращения микрометрического винта 3 и регулировки усилия, прикладываемого к измерительным поверхностям прибора.
8. Эталон, который служит для проверки и настройки инструмента. Не предусмотрен для некоторых моделей микрометров МК-25.

Вариант 2. Калибровка системы цифровой визуализации

1. Средствами ПО вывести изображение с цифровой камеры на экран монитора компьютера;
2. Извлечь Объект-Микрометр из футляра. Осмотреть стекло микрометра, при необходимости – очистить;
3. Поместить Объект-Микрометр на предметный стол микроскопа;
4. Используя объектив 4х, установить с помощью регулировок микроскопа фокус на шкале микрометра, используя окружность, и отцентровать в поле зрения шкалу Объект-Микрометра путем перемещения предметного стола.
5. Переключиться на необходимый для измерения объекта объектив.
6. Установить наиболее часто используемое разрешение цифровой камеры микроскопа,
7. Добиться резкого изображения шкалы калибровочного Объект-Микрометра, отрегулировав фокусное расстояние и положение предметного стола с помощью регулировок микроскопа;
8. Получить на экране монитора контрастное изображение шкалы Объект-Микрометра и сделать фотографию изображение средствами ПО, на основании руководства к ПО.
9. Средствами ПО для видеозахвата осуществить калибровку единиц измерения, осуществляемую сохранением коэффициента для пересчета количества единиц «пиксели» в «микрометры» или иные метрические единицы системы СИ.

Микроскопы, дающие увеличение в сотни (све­товой) или тысячи (электронный) раз, используют для изучения морфологии и строения микроорганизмов. Про­изводственные микробиологические лаборатории снабже­ны световыми микроскопами различных типов отечест­венного и импортного производства. Преимущество за бинокулярными микроскопами с автономной подсветкой и полным набором основных и дополнительных оптиче­ских систем.

3.1. СВЕТОВОЙ МИКРОСКОП

Микроскоп состоит из механической и оптиче­ской частей (см. рис. 2)

К механической части микроскопа относят штатив, который состоит из подставки (башмак) 9, придающей прибору устойчивость, и тубусодержателя.

К тубусодержателю 12 прикреплены:

Тубус 14, имеющий у различных моделей современных микроскопов конструктивные отличия.

В нижней части тубуса находится револьверный меха­низм 18 – вращающийся диск с гнездами для объективов, состоящий из двух пластин. Верхняя из них закреплена на­глухо, а нижняя с отверстиями и резьбой для объективов свободно передвигается, причем центрировка ввинченного в отверстие объектива фиксируется защелкивающейся пру­жинкой, попадающей в соответствующую прорезь.

Рис.2

Общий вид (а) и схема (б) микроскопа:

1 – микрометрический винт; 2 – макрометрический винт; 3 – стопорный винт; 4 – центрировочный винт для установки препарата; 5 – пружинные клеммы; 6 – винт для укрепления тубуса; 7 – сто­порный винт конденсора; 8 – рукоятка перемещения диафрагмы; 9 – башмак микроскопа; 10 – ко­роб­ка с микромеха­низмом; 11 – кронштейн конденсора; 12 – тубусодержатель; 13 – окуляр; 14 – наклонный тубус; 15 – призма; 16 – головка тубусодержателя; 17 – винт для фиксации револьвера; 18 – револьвер на салазках; 19 – объективы; 20 – пред­метный столик; 21 – конденсор; 22 – апертурная диафрагма; 23 – зеркало.

Предметный столик 20, круглый или прямоугольный с отверстием в центре для прохождения света. Столик можно передвигать при помощи винтов 4 в двух взаимно перпендикулярных направлениях. Для закрепления пре­парата на столике имеются специальные зажимы 5 раз­ной конструкции.

Механизм для передвижения тубуса вверх-вниз состо­ит из двух основных узлов – макро- 2 и микрометриче­ского 1 винтов.

Макрометрический винт (кремальера) служит для бы­строго поднятия и опускания тубуса при грубой настрой­ке. Один оборот зубчатого колеса позволяет перемещать тубус на 20 мм вверх или вниз.

Микрометрический винт предназначен для передви­жения тубуса при тонкой настройке и просматривания препарата в глубину. Полный оборот ведущего колесика продвигает тубус на 0,1 мм. Барабан винта разделен на 50 делений, каждое деление равно 0,002 мм.

Оптическая часть микроскопа состоит из осветитель­ного устройства, окуляров и объективов.

Осветительное устройство состоит из конденсора, ирис-диафрагмы и осветителя (или плосковогнутого зеркала).

Конденсор 21 применяют для концентрирования отра­женных зеркалом лучей света, фокус которых должен на­ходиться в плоскости препарата. Он состоит из двух линз, заключенных вместе с ирис-диафрагмой в общую цилин­дрическую оправу. Верхняя линза в конденсоре плоско­выпуклая, нижняя – двояковыпуклая. Весь конденсор можно пере­двигать вверх и вниз при помощи особого вин­та. При поднятии и опускании конденсора меняется угол сходимости лучей, в результате меняется и интенсивность освещения: при поднятом конденсоре – освещение ярче, при опущенном – слабее.

Под конденсором помещена апертурная (ирисовая) диафрагма 22. Ирис-диафрагма состоит из нескольких подвижных сегментов, сдвигаемых и раздвигаемых при помощи рычажка 8. Диафрагма установлена перед ниж­ней линзой конденсора и позволяет также регулировать освещение. Изменяя диаметр отверстия, через которое проходит пучок света, регулируют интенсивность освеще­ния поля зрения.

Если апертура конденсора меньше апертуры рабочего объектива, то из-за слабого потока света возможности лин­зы объектива задействованы не полностью. Если апертура конденсора больше апертуры рабочего объектива, что ха­рактерно для объективов малого увеличения, то уменьша­ют диаметр отверстия ирисовой диафрагмы конденсора.

Зеркало 23 подвижно закреплено под конденсором на особом рычажке, при помощи которого оно может быть установлено в любой плоскости. Одна его поверхность пло­ская, другая – вогнутая. При работе с конденсором ис­пользуют плоскую, без конденсора – вогнутую поверх­ность зеркала. При дневном свете пользуются плоской сто­роной зеркала, при искусственном свете – вогнутой.

При микроскопировании существенное значение име­ет освещение исследуемого объекта. Освещение чаще уста­навливают по методу Келлера.

1. Осветитель (при работе с зеркалом желательно ис­пользовать стандартные осветители ОИ-7 и ОИ-19, содер­жащие микролампу с небольшой плотно скрученной спи­ралью, которую можно передвигать вдоль оси осветите­ля) располагают на расстоянии 30–40 см от микроскопа.
2. На предметный столик ставят препарат, в рабочее положение переводят объектив 8×.
3. Конденсор поднимают до упора, полностью откры­вают ирисовую диафрагму.
4. Зеркало устанавливают плоской поверхностью и почти полностью закрывают диафрагму осветителя.
5. На зеркало помещают лист белой бумаги и, передви­гая патрон осветителя, доби­ваются четкого изображения на бумаге нити накала лампы.
6. Глядя в окуляр, при помощи зеркала получают в центре поля зрения изображение краев диафрагмы осве­тителя – светлое пятно с нерезко очерченными краями.
7. Используя объектив 8×, фокусируют объект в обла­сти светлого пятна.
8. Опуская конденсор, в плоскости препарата фоку­сируют изображение краев диа­фрагмы осветителя и дви­жением зеркала переводят светлое пятно в центр поля зрения.
9. Диафрагму осветителя открывают до тех пор, пока светлое пятно не закроет все поле зрения.
10. В дальнейшем положение зеркала, конденсора и диафрагмы осветителя больше не меняют.

При работе со встроенными стационарными осветите­лями правила настройки подробно изложены в инструк­циях по эксплуатации микроскопов.

Окуляр 13 вставляют в верхнюю часть тубуса. Увели­ченное объективом изображение дополнительно увеличи­вается окуляром, но новых деталей структуры при этом не наблюдается. Обычно окуляр состоит из двух плоско­выпуклых линз – глазной и собирательной, – обращен­ных своими выпуклыми поверхностями вниз к объекти­ву. Линзы заключены в общую металлическую трубку, между линзами находится диафрагма поля зрения мик­роскопа. У современных биологических микроскопов имеются окуляры с увеличениями в 7, 8, 10 и 15 раз. Размер увеличения указан на верхней оправе.

Объектив – основная часть оптической системы мик­роскопа, дающая увеличенное изображение предмета. Объ­ектив состоит из нескольких линз, помещенных в метал­лическую трубку и закрепленных канадским бальзамом. На верхней части трубки имеется резьба, при помощи ко­торой объектив ввинчивается в гнездо револьверной пла­стинки. Самая нижняя плосковыпуклая линза объекти­ва, обращенная к предмету, называется фронтальной; именно она позволяет получать увеличение, а остальные линзы только устраняют оптические недостатки изобра­жения (сферическую и хроматическую аберрацию); чем больше кривизна фронтальной линзы и меньше ее разме­ры, тем большее увеличение предмета дает объектив. Изо­бражение предмета обратное.

Современные биологические микроскопы обычно снаб­жены объективами с увеличением в 8, 10, 20, 40, 60 и 90 раз. Эти цифры указаны на объективе. При работе с объективами, увеличивающими в 60, 90 и более раз, фрон­тальная линза погружается в жидкость.

Важно получить не только увеличенное, но и четкое изображение исследуемого объекта.

Четкость изображения зависит от разрешающей спо­собности микроскопа, которую понимают как минималь­ное расстояние между двумя точками, при котором они видны раздельно. Разрешающая способность микроскопа зависит от числовой апертуры и длины волны используе­мого света.

Повысить разрешающую способность микроскопа мож­но за счет применения более коротких лучей света или, что более доступно, за счет приближения показателя пре­ломления среды, граничащей с линзой, к аналогичному показателю стекла. С этой целью прослойку воздуха меж­ду линзой объектива и предметным стеклом замещают спе­циальной жидкостью с показателем преломления, близким к показателю преломления стекла. Особенно это необхо­димо при использовании объективов большого увеличе­ния (60×, 90×) с фронтальными линзами малой площади.

Рис. 3

Ход лучей в сухом (а), водно- (б) и масляно-иммерсионном (в) объективе:

п – показатель преломления; РО – препарат; f – фронтальная линза объекти­ва; d – покровное стекло.

Показатель преломления стекла и воздуха составляет соот­ветственно 1,52 и 1,0, поэтому в качестве иммерсионных жидкостей, создающих оптически однородную среду меж­ду предметным стеклом и линзой объектива, чаще всего при­меняют кедровое масло (п = 1,5), глицерин (п = 1,4), воду (n = 1,3). Ход лучей света при использовании обычного су­хого и иммерсионного объективов показан на рисунке 3.

Объективы для масляной иммерсии обозначают « МИ», водной – «ВИ».

Общее увеличение, даваемое системой объектива и окуляра, равно произведению увеличений окуляра и объ­ектива. Например, при окуляре 15× и объективе 40× уве­личение будет: 15 × 40 = 600 раз.

При работе с сильными объективами толщина покров­ного стекла не должна превышать 0,15– 0,18 мм ввиду ма­лого рабочего расстояния.

Под рабочим расстоянием объектива понимают рас­стояние от плоскости фронтальной линзы до изучаемого объекта при нахождении последнего в фокусе. Чем боль­ше увели­чение объектива, тем меньше рабочее расстоя­ние и поле зрения.

На корпусе объектива обозначена его увеличивающая способность (8×, 20×, 40×, 90×) и числовая апертура.

Числовая апертура А отражает количество света (рис. 4), попадающего в линзу.

Величина ее определяется по формуле

А = п sin и,

где А – числовая апертура линзы; п – показатель пре­ломления среды, граничащей с линзой; и – половина отверстного угла a.

Рис.4

Схема хода лучей при разном значении угла a:

А – объект; О – объектив; и – половина отверстного угла.

Микроскопы необходимо хранить под чехлами или кол­паками для защиты от пыли. Удобно пользоваться чехла­ми из полиэтилена; не следу­ет оставлять микроскоп под солнечными лучами или в те­плом месте, так как может размягчиться клей, которым склеены линзы.

В комнате, где установлен микроскоп, не должно быть паров кислот и водяных паров. При переносе микроскоп следует брать только за тубусодержатель и следить за тем, чтобы окуляр не выпал из тубуса.

Для наружной очистки оптики применяют смоченные спиртом мягкие ткани, лучше фланель, не оставляющие после себя волокон. Использование ксилола и бензина для этих целей может привести к расклеиванию линз.

3.1.1. ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ ОПТИЧЕСКИЕ СИСТЕМЫ

Фазово-контрастное устройство. Устройство включа­ет в себя: а) фазовую пластинку – расположенный в зад­ней фокальной плоскости объектива прозрачный диск, на поверх­ность которого напылено кольцо из металлов (фа­зовое кольцо); б) кольцевую диафрагму – помещенную под конденсором светонепроницаемую пластину с прозрач­ным кольце­вид­ным участком.

Световая волна при прохождении через живую клетку отстает по фазе приблизительно на 1/4 длины волны и до­полнительно сдвигается еще на 1/4 после прохождения через фазовую пластинку. Ход лучей в фазово-контрастном устройстве показан на рисунке 5. Сдви­нутые по фазе после прохождения через фазовую пластинку лучи либо совпадают и скла­ды­ваются с прямыми лучами, идущими мимо объекта, либо оказываются в противофазе. В пер­вом случае исследуемый объект виден как светлый на тем­ном фоне, а во втором – как темный на светлом фоне.

Рис.5

Схема хода лучей при использовании фазово-контрастного устройства:

1 – кольцевая диафрагма; 2 – кон­денсор; 3 – объект; 4 – объек­тив; 5 – фазовая пластинка.

Рис.6

Фазово-контрастное устройство КФ-4:

1 – конденсор; 2 – револьверный диск с набором кольцевых диа­фрагм; 3 – центрировочные винты; 4 – вспомогательный окуляр; 5 – на­бор фазовых объективов.

В микробиологии широко применяют фазово-контра­стное устройство КФ-4 (рис. 6) (объект виден темным на светлом фоне). Последовательность перехода к работе с фазово-контрастным устройством следующая.

1. Обычный конденсор заменяют на фазово-контрастный, а объектив 40× – на анало­гичный фазовый объектив.
2. Диск револьвера конденсора поворачивают до появ­ления в окошечке цифры 0; диафрагму конденсора пол­ностью открывают.
3. Используя объектив 8×, устанавливают освещение по Келлеру.
4. Обычный окуляр заменяют на вспомогательный и с помощью тубуса добиваются четкого изображения фазо­вой пластинки в виде темного кольца.
5. Устанавливают кольцевую диафрагму, соответст­вующую объективу 40×. В этом слу­­­чае наряду с темным кольцом фазовой пластинки можно видеть светлое коль­цо диафрагмы.
6. При помощи центрировочных винтов совмещают фазовое кольцо и кольцо диафрагмы.
7. Вспомогательный окуляр заменяют обычным и микроскопируют препарат.

При работе с другими объективами устанавливают со­ответствующие диафрагмы.

Темнопольный конденсор. При темнопольной микро­скопии используют специ­альный конденсор с затемнен­ной центральной частью, поэтому в плоскость объекта идут только боковые лучи, отраженные от внутренних зер­кальных поверхностей конденсора. Лучи направлены под таким углом, что не попадают в линзу объектива, и поэто­му поле зрения выглядит темным (рис. 7). Та часть лучей, которая попадает на объект, отражается в линзу объекти­ва, что позволяет видеть светлое изображение объекта на темном фоне.

Рис.7

Ход лучей в темнопольных конденсорах:

а – параболоид-конденсор; б – кардиод-конденсор; 1 – объектив; 2 – иммерсионное масло; 3 – препарат; 4 – зер­кальная поверхность; 5 – диафрагма.

Чтобы перейти к методу темнопольной микроскопии, поступают следующим образом.

1. Вынимают окуляр, светлопольный конденсор и вы­винчивают один из объективов (8×).
2. Прикрывают диафрагму осветителя и фокусируют нить накала лампы на листе белой бумаги, помещенном на зеркале. (Установка освещения по Келлеру.)
3. Раскрывают диафрагму осветителя, закрывают ма­товым стеклом конец тубуса и с помощью зеркала добива­ются равномерного освещения поля зрения.
4. Ставят на место окуляр, объектив 8×, темнопольный конденсор, положение зеркала при этом не меняют.
5. На линзу конденсора наносят каплю дистиллиро­ванной воды, на столик помещают препарат «раздавлен­ная капля» таким образом, чтобы вода на линзе конден­сора контактировала с нижней поверхностью предмет­ного стекла.
6. Глядя в окуляр, при помощи центрировочных вин­тов переводят в центр поля зрения свет­лое кольцо с тем­ным пятном в центре. Далее регулируют видимость объ­екта в поле зрения.

3.1. МИКРОСКОПИЯ

Приступая к работе с микроскопом, проверя­ют состояние конденсора: он должен быть поднят до уров­ня предметного столика, диафрагма открыта. Приподняв тубус микро­скопа, устанавливают объектив с наимень­шим увеличением (8×, 10×); глядя в окуляр, при помощи зеркала добиваются полного освещения поля зрения. За­тем на исследуемый препарат наносят каплю кедрового масла (или его заменителя), помещают препарат на пред­метный столик, поворотом револьвера устанавливают им­мерсионный объектив. (Чтобы избежать соприкосновения объектива со столиком, тубус следует держать приподня­тым.) Под контролем глаза (смотреть сбоку) фронтальную линзу объектива легким поворотом макрометрического винта погружают в каплю иммерсионного масла и, на­блюдая в окуляр, осторожно поднимают тубус до види­мости препарата. Затем легкими поворотами микромет­рического винта (вперед-назад) регулируют четкость изо­бражения.

При смене препарата тубус микроскопа поднимают, препарат снимают с предметного столика и, если исследо­вание проводилось с иммерсионной системой, фронталь­ную линзу объектива тщательно очищают от масла, про­терев салфеткой, смоченной спиртом.

В конце работы тубус приподнимают макровинтом, револьвер переводят в нейтраль­ное положение, масло с линзы осторожно снимают мягкой хлопчатобумажной тканью. Микро­скоп убирают в деревянный футляр или накрывают стеклянным колпаком (лучше из цветного стекла) для защиты от света.

Микроскопированием определяют морфологические особенности микроорганизмов, их тинкториальные свой­ства, подвижность, наличие специальных структурных элементов (спора, капсула).

Приготовленные препараты «раздавленная капля» и «висячая капля» просматривают с объективами 20× или 40×.

Фиксированные окрашенные препараты микроскопируют вначале с объективом 40×, потом – с объективом 90×. В правильно окрашенном и хорошо промытом препарате поле зре­­ния остается светлым и чистым, а окрашенными оказываются клетки микро­орга­низмов.

Чтобы исследовать под микроскопом живые нефикси­рованные неокрашенные микроорганизмы, используют особые оптические системы: фазово-контрастное устрой­ство и темнопольный конденсор.

3.3. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ В СВЕТЛОПОЛЬНОМ МИКРОСКОПЕ

Микроскопическое исследование микроорга­низмов проводят в живых или фиксированных окрашен­ных препаратах.

3.3.1. ПРИГОТОВЛЕНИЕ ПРЕПАРАТОВ

Приготовление живых препаратов. Микроскопия кле­ток в живом состоянии применяется главным образом для изучения их размеров, формы, структуры, подвижности, характера размножения, отношения клеток к различным химическим раздражителям. С этой целью наиболее часто готовят препараты «раздавленная капля» и «висячая кап­ля». Микроорганизмы в этих препаратах можно подвергать прижизненной окраске. Так как большинство используе­мых в микробиологии красителей токсичны, для прижиз­ненного окрашивания микроорганизмов их используют в очень малых концентрациях от 0,001 до 0,0001%. В препа­рате «висячая капля» микроорганизмы можно наблюдать в течение продолжительного времени – неделю и более.

«Раздавленная капля». Готовят предметные и покров­ные стекла для микроскопии. Они должны быть чистыми и хорошо обезжиренными, чтобы нанесенная на них кап­ля равномерно растекалась. Достигается это несколькими способами. Стекла можно прокипятить 15 мин в 1%-ном растворе соды или в мыльной воде, сполоснуть водо­про­вод­ной водой, поместить на 5–10 мин в слабую хлористоводо­родную кислоту и хорошо промыть дистиллированной во­дой. Можно также готовить стекла к работе, выдержав их предварительно 2 ч в концентрированной серной кислоте или хромовой смеси. После это­го промыть их в проточной воде, прокипятить в 2%-ном растворе щелочи в течение 10 мин, тщательно промыть проточной, а затем дистилли­рованной водой. Обезжиренные предметные стекла можно приготовить, используя для этой цели кусочек мыла, ко­торым необходимо натереть рабочую поверхность стекла, а затем тщательно вытереть ее сухой салфеткой. Чистые стекла поместить на хранение в сосуды с притертыми пробками в смеси равных объемов спирта и эфира или в 96%-ный спирт.

Затем для приготовления препарата на чистое и обез­жиренное предметное стекло бактериологической петлей или пастеровской пипеткой наносят каплю исследуемой культуры. Если микроорганизмы находились в суспензии (в жидкой питательной среде), их наносят непосредственно на предметное стекло. Если же материал взят с плот­ной питательной среды, тогда его вносят в нанесенную предварительно на предметное стекло каплю стерильной водопроводной воды, стерильного физиологического рас­твора или какой-либо жидкой питательной среды. Мож­но также из культуры, выращенной на плотной питатель­ной среде, предварительно приготовить суспензию мик­роорганизмов. Для этого в пробирку с микроорганизмами, выросшими на агаровой поверхности, вносят 4–5 см3 сте­рильного физиологического раствора или водопроводной воды и, вращая про­бирку между ладонями, смывают мик­робные клетки с поверхности среды. Кроме того, можно в пробирку с 4–5 см3 стерильной воды бактериологической петлей перенести 1–2 колонии исследуемых микроорга­низмов, выросших на агаре в чашке Петри.

На предметное стекло на край капли опустить ребром под углом 45° покровное стекло и, осторожно наклоняя, накрыть им каплю так, чтобы в ней не образовались пу­зырьки воздуха (рис. 8).

Каплю нужно брать такой величины, чтобы она запол­няла все пространство между покровным и предметным стеклами и не выступала за края покровного стекла. Если жидкость будет нанесена в избытке, ее необходимо уда­лить при помощи полосок фильтровальной бумаги.

Рис. 8

Схема приготовления препарата «раздавленная капля»:

а – вид сверху; б – вид сбоку; / – пред­метное стекло; 2 – покровное стекло.

«Висячая капля». Для приготовления препарата «ви­сячая капля» взять стекло со шлифованной лункой. Края лунки смазать вазелиновым маслом. На покровное стекло стерильно в центр нанести каплю исследуемого материала (см. рис. 9). Затем предметное стекло перевернуть лункой вниз и поместить на покровное стекло так, чтобы капля нахо­дилась в центре лунки, не сопри­касаясь с ее краями. Предметное стекло легонько прижать к по­кровному и перевернуть. В об­разовавшейся герметичной ка­мере капля не высыхает, что позволяет наблюдать за микро­организмами продолжительное время.

Рис.9

Схема приготовления препарата «висячая капля»:

• – предметное стекло с лункой; 2 – капля; 3 – покровное стекло.

Приготовление фиксированных препаратов. Фиксированный окрашенный препарат микроорганизмов готовят в несколько этапов: приготовление мазка, высушивание его, фиксация и окрашивание.

Мазки готовят на чистых обезжиренных предметных стеклах из микробных суспензий или из культур, выра­щенных на плотных питательных средах. Если необходи­мо изучить естественное расположение микроорганизмов в колониях, выращенных на поверхности плотной пита­тельной среды или естественного субстрата, то готовят препарат-отпечаток.

Высушивают мазки или препараты-отпечатки при ком­натной температуре, так как высушивание при высокой температуре нарушает форму клеток.

На следующем этапе мазок фиксируют. При этом клет­ки прочно прикрепляются к поверх­но­сти стекла, повыша­ется их сродство к красителям и, наконец, клетки гибнут. Самый простой и распространенный способ фиксации – фиксация жаром, пригоден для наблюдения морфологии клеток, но не для изучения их строения, так как при воз­действии высоких температур структура клеток сущест­венно изменяется. Помимо жара, фиксацию можно про­водить химическими веществами (жидкостями и парами). Для этого исполь­зуют 96%-ный этиловый спирт (время фиксации 5–10 мин), смесь Никифорова, состоящую из абсолютного этилового спирта и эфира в соотношении 1:1 (10–15 мин), безводный метиловый спирт (3–5 мин), ацетон (5 мин), пары параформальдегида и др. Для дрожжей приоритетными являются химические методы фиксации.

Для химической фиксации микроорганизмов чаще всего используют следующие химические растворы:

1. Жидкость Карнуа:

Ледяная уксусная кислота…. 10 см3

Этиловый спирт, 96°…………. 60 см3

Хлороформ………………………. 30 см3

Хранить жидкость следует в бутылках с притертой пробкой. Она может храниться длительное время, но луч­ше пользоваться свежеприготовленным раствором. Жид­кость Карнуа является хорошим фиксатором для изуче­ния строения бактерий. Экспозиция фиксации 15 мин.

1. Смесь Никифорова:

Этиловый спирт, 96°………… 1 часть

Эфир………………………………. 1 часть

Для фиксации препарат погружают в стакан с жидко­стью на 15-20 мин, после чего вынимают и дают возмож­ность подсохнуть.

1. Спирт-формалин:

Этиловый спирт, 96°…………. 95 см3

Формалин………………………….. 5 см3

Для фиксации препарат погружают в стакан с жидко­стью на 15 мин, после чего выни­мают и дают возможность подсохнуть.

После фиксации препарат окрашивают. Большинство красок, применяемых в микробиологической практике, представляют собой соединения, чаще всего производные бензола и его гомологов, которые получают либо путем химического синтеза, либо из каменноугольной смолы. Они могут быть основными, кислыми и нейтральными. В лабораторных условиях можно быстро определить, ка­кой характер (кислый или основной) имеет водный рас­твор того или иного красителя. Для этого на фильтроваль­ную бумагу наносят каплю исследуемой краски. Так как фильтровальная бумага заряжена отри­цательно, то при основных свойствах краски вода растекается в виде бес­цветной зоны вокруг фиксированного пятна краски, при кислых – краска и вода растекаются одинаково. Основ­ные краски соединяются с веществами клетки, имеющи­ми кислые свойства, а кислые – с веществами с основ­ными свойствами. В практике микробиологических ис­следо­ваний чаще используются основные краски. Это объясняется тем, что большинство микроорганизмов не­сут на поверхности клетки отрицательный электрический заряд и в их цитоплазме преобладают вещества с кислы­ми свойствами. Исходя из сродства клеточных веществ к основным, кислым или нейтральным краскам, введены соответственно понятия «базофилия», «ацидофилия» и «нейтрофилия». Такое деление, однако, является относи­тельным, так как большинство клеточных веществ явля­ются амфотерными соединениями и в зависимости от зна­чения рН среды могут приобретать кислые, нейтральные или основные свойства.

В микробиологической практике наиболее употреби­тельными красками являются:

• красные – фуксин основной и фуксин кислый, ней­тральный красный, конго красный, эозин К, эритрозин;
• синие – метиленовый голубой, толуидиновый голу­бой;
• зеленые – малахитовый зеленый, бриллиантовый зе­леный, янус зеленый;
• фиолетовые – генциан фиолетовый, кристаллический фиолетовый, гематоксилин;
• коричневые – основной коричневый, хризоидин;
• желтые – пикриновая кислота, флуоресцеин;
• черные – индулин спирторастворимый, нигрозин во­дорастворимый и др.

Использование разных красок, их концентрация и продолжительность воздействия на клетки обусловлива­ются особенностями выявляемых структур и свойствами красителей.

Процедура приготовления фиксированного окрашен­ного препарата. С помощью стерильной бактериологиче­ской петли или пипетки Пастера нанести на тщательно обез­жи­ренное предметное стекло каплю суспензии мик­роорганизмов. Материал с плотных питательных сред взять бактериологической петлей и внести его в каплю стерильной водопроводной воды, предварительно нанесен­ную на предметное стекло. Микробный материал равно­мерно тонким слоем растереть на площади 1,5–2 см2 и высушить приготовленный мазок при комнатной темпе­ратуре.

После высушивания мазок зафиксировать в пламени горелки. Держа стекло мазком вверх, трижды провести его через пламя горелки. Во избежание перегрева микро­организмов время прямого воздействия пламени не долж­но превышать 3–4 с. Для лучшего сохранения морфоло­гических параметров клетки целесообразно использовать химические методы фиксации.

Препарат поместить мазком вверх на мостик из двух параллельных стеклянных палочек, соединенных резино­выми трубками и находящихся на стенках кюветы или кристаллизатора.

Подготовленный таким образом препарат окрасить по методике, соответствующей поставленной задаче. Высу­шить его на воздухе или легко промокнуть фильтроваль­ной бумагой. Края стекла и тыльную сторону тщательно протереть салфеткой или фильтровальной бумагой. Таким образом препарат готов к микроскопированию.

3.3.2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ РАЗМЕРОВ КЛЕТОК МИКРООРГАНИЗМОВ

Клетки микроорганизмов измеряют под микроскопом с помощью окулярной линейки-микрометра или окуляр­ного винтового микрометра. Для измерения лучше ис­пользовать живые, а не фиксированные клетки, так как фиксация и окраска приводят к некоторому изменению истинных размеров клеток. Размеры клетки удобно оп­ределять с помощью фазово-контрастного устройства. Если клетки подвижны, препарат слегка подогревают или к капле исследуемой суспензии добавляют каплю 0,1%-ного водного раствора агара. Размеры клеток вы­ражают в микрометрах.

Объективный микрометр (объект-микрометр) – это металлическая пластинка с отвер­стием в центре. В отвер­стие вставлено стекло, на ко­торое нанесена линейка дли­ной 1 мм (рис. 10).

Рис. 10

Объективный микрометр (вид под микроскопом)

Она разделена на 100 частей, т. е. деление объектив­ного микрометра соответствует 0,01 мм, или 10 мкм. Для определения цены деления окулярного микрометра объ­ективный микрометр помещают на столик микроскопа и фокусируют при малом увеличении. Изо­бражение линей­ки перемещают в центр поля зрения и только после этого меняют объектив на тот, при котором будут определяться размеры клеток. Перемещая столик микро­скопа и пово­рачивая окуляр устанавливают микрометры так, чтобы их шкалы были параллельны, и одна перекрывала дру­гую. Цену деления окулярного микрометра определяют по принципу нониуса, т. е. совмещают одно из делений шкалы окулярного и объективного микрометров и нахо­дят следующее их совмещение (рис. 11). Устанав­ливают, скольким делениям объективного микрометра соответст­вует одно деление окулярного микрометра.

Пример. Два деления объект-микрометра (20 мкм) со­ответствуют пяти делениям окуляр-микрометра. Следова­тельно, одно деление окуляр-микрометра равно 4 мкм (20:5).

Если теперь на столик микроскопа поместить препарат с клетками микроорганизмов и рассматривать его при том же увеличении, то можно измерить величину клетки. Для этого определяют, какому числу делений окулярной линей­ки соответствует величина измеряемого объекта, и умно­жают это число на цену деления окулярного микрометра.

Рис. 11

Совмещение измеритель­ных линеек в микроскопе (принцип нониуса):

• – шкала объект-микрометра; 2 – шкала окуляр-микрометра.

Окулярный микрометр (окуляр-мик­рометр) представляет собой круглую стек­лянную пластинку (рис. 12), в центре ко­торой выгравирована линейка длиной 5 мм. Линейка разделена на 50 частей. Окулярный микрометр вставляют в оку­ляр. Для этого вывинчивают глазную лин­зу окуляра, помещают на его диафрагму окулярный микрометр делениями вниз и завинчивают линзу.

Рис. 12

Окулярный микрометр (в окуляре микроскопа)

Однако только с помощью окуляр-микрометра нельзя непосред­ственно измерить величину клетки, так как по­следние рассматриваются через объектив и окуляр, а де­ления линейки – только через верхнюю линзу окуляра. Поэтому, прежде чем приступить к измерению величины клеток, необходимо определить цену деления окулярного микрометра для данного увеличения микроскопа. Это де­лают с помощью объективного микрометра.

Винтовой окулярный микрометр (рис. 13) закрепляют на тубусе микроскопа, предварительно вынув окуляр. В оку­ляре винтового микрометра имеется неподвижная шкала с ценой деления 1 мм для определения размеров крупных объектов и подвижная стеклянная пластинка с перекрести­ем. Пластинка связана с микрометрическим винтом-ба­рабаном и перемещается вместе с перекрестием при его вращении. Для измерения длины клетки вращением мик­рометрического винта-барабана окулярного микрометра подводят перекрестие к концу клетки и отмечают деле­ние на барабане. Затем, вращая барабан, перемещают пе­рекрестие до другого конца клетки и вновь отмечают деле­ние на барабане. Определяют, скольким делениям микро­метрического винта-барабана соответствует длина клетки, и умножают полученное значение на цену деления бараба­на при данном увеличении микроскопа.

Рис. 13

Винтовой окулярный микрометр

Пример. Одно деление объективного микрометра, т. е. 10 мкм, соответствует X деле­ниям микрометрическо­го винта-барабана; следовательно, одно деление его при данном увеличении микроскопа равно 10:Х (мкм).

Цену деления барабана для каждого объектива опре­деляют с помощью объект-микрометра. С этой целью под­водят перекрестие к началу одного деления объективного микрометра и отмечают деление на барабане. Затем, вра­щая барабан, перемещают перекрестие до конца деления объективного микрометра и вновь отмечают деление на барабане. Определяют, скольким делениям микрометри­ческого винта-барабана соот­ветствует одно деление объ­ективного микрометра.

Для получения достоверных результатов необходимо измерить не менее 20–30 клеток. При определении разме­ров клеток округлых форм измеряют их диаметр, у кле­ток других форм – длину и ширину; указывают средние размеры клеток и пределы колебаний, т. е. минимальные и максимальные размеры.